Forsøksdyr: Effekt av stamceller fra humane melketenner på inflammasjon, demyelinisering og axonal skade i eksperimentelle musemodeller av MS


Godkjenningsdato 09.11.2020

Godkjenningsperiode 01.12.2020-31.12.2021

1 Formål
Formålet til dette forsøket er primært å undersøke om og i hvor stor grad stamceller fra melketenner (SHEDs) eller fra beinmarg (BM-MSC) kan motvirke betennelse og skader på myelin og nerveceller i sentralnervesystemet i eksperimentelle musemodeller av MS.

2 Skadevirkninger
Forsøket gjøres ved å bruke to validerte modeller for MS-lignende sykdom hos mus: Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) og cuprizonemodellen. Moderat belastende

3 Forventet nytteverdi
En mulig nevroprotektiv behandling mot MS vil være av stor verdi for pasienter som får MS, og også andre sykdommer som forårsaker skader på sentralnervesystemet.

4 Antall dyr og art
95 Mus (c57Bl/6) av hunkjønn

5 Hvordan etterleve 3R
Reduction: Tallet på antall mus i forsøket er basert på styrkeberegning fra en tidligere mindre studie som brukte SHEDs som behandling ved EAE-modellen. På denne måten vil man være sikker på at antall mus som brukes er så lav som mulig, samtidig som validiteten av studien ikke påvirkes negativt. Antallet mus i kontrollgruppene er halvert i forhold til tallet i behandlingsgruppene for å minske tallet på mus i forsøket.

Replacement: Både EAE og cuprizone-modellen er validerte modeller for MS, selv om det likevel er flere ulikheter mellom MS hos mennesker og disse modellene når det gjelder klinisk forløp og patogenese. Ved å bruke begge disse modellene kommer man imidlertid nærmere en komplett MS-modell ettersom EAE og cuprizone-modellene utfyller hverandre hvor EAE-modellen involverer en immunrespons, mens dette ikke forligger ved Cuprizone. Et tilsvarende forsøk vil ikke være mulig ved å bruke in-vitro modeller som bruk av vevskive (organotypic model) fra hjernevev e.l. Det er i dag derfor ingen andre modeller som kan erstatte dyremodeller for denne typen studier.

Refinement: Flere tiltak vil bli iverksatt for å gjøre forsøket så skånsomt som mulig. Musene blir avlivet på et tidlig stadium i både EAE- og cuprizonemodellen. Det vil også bli brukt kriterier når det gjelder nevrologiske utfall og vekttap hvor musene vil bli avlivet på et tidligere tidspunkt dersom disse overskrides. Nevrologiske symptomer vil bli monitorert annen hver dag og vekttap to ganger i uken. Musene vil få fri tilgang til fôr og fri tilgang på vann som vil være lett tilgjengelig. Musene oppstalles 5 og 5 i IVC-II bur med rikelig materiale for å lage reir. EAE-musene vil bli huset sammen med mus i kontrollgruppene for å optimalisere termoreguleringen til EAE-musene.
Avliving etter endt forskningsperiode skjer ved hjertetapping under kirurgisk anestesi med hypnorm/dormikum. Metoden er valgt for å gi minst mulig ubehag for musene under avlivingen og for å få tilstrekkelig mengder blod fra musene til videre analyser.

 

Begrunnelse for etterevalueringen

Mattilsynet er forpliktet etter regelverket til å etterevaluere alle forsøk som er betydelig belastende for forsøksdyrene. Vi har derfor satt som vilkår for tillatelsen at søker skal sende inn dokumentasjon som gjør det mulig for oss å evaluere 1) om forsøkets formål ble nådd, 2) hvilke skadevirkninger dyrene ble utsatt for og 3) faktorer som kan medvirke til at fremtidige forsøk blir bedre mht. 3R. Slik informasjon må sendes via FOTS.

Etterevaluering

Forsøket gikk ut på å undersøke effekten av mesenkymale stamceller på skader på sentralnervesystemet ved MS-lignende sykdomsmodeller. Som modeller ble her cuprizone og EAE brukt.
Begge modellene lot seg indusere.
Forsøket gikk som forventet praktisk sett, og de histologiske undersøkelsene vil nå utføres for å undersøke resultatene.
Funnene vil bli publisert uansett resultat.

Forsøket har gitt nytte ved at man får mer kunnskap om effekt av mesenkymal stamcellebehandling ved MS-lignende sykdom. Det finnes så langt ingen behandling som kan reparere skadene ved MS, og kunnskap som kan bringe dette feltet videre er derfor viktig.

95 mus ble brukt, hvorav cuprizone-forsøket vurderes som moderat belastende og EAE-forsøket som betydelig belastende.
I søknaden ble cuprizone-forsøket oppgitt til moderat alvorlighetsgrad. EAE-ble opprinnelig oppgitt til moderat alvorlighetsgrad, men ble endret til betydelig belastende grad av Mattilsynet. Siden de fleste dyrene (24/35) ble vurdert til betydelig belastningsgrad (dvs lammelse med EAE grad 3 eller mer), samsvarer EAE-forsøket best med betydelig belastningsgrad. Cuprizone- forsøket vurderes å samsvare med moderat alvorlighetsgrad.

Oversikt over forsøksdyrene:
1. Pilot cuprizone - 5 mus - 5 med moderat belastningsgrad.
2. Pilot EAE - 5 mus - 5 med mild belastningsgrad (ingen oppnådde sykdom).
3. Ny pilot EAE - 5 mus - 5 med mild belastningsgrad (ingen oppnådde sykdom).
4. Ny pilot EAE - 10 mus - 3 med betydelig belastningsgrad og 7 med moderat alvorlighetsgrad (musene ble avlivet på et tidligere tidspunkt enn i hovedforsøket med EAE).
5. Hovedforsøk Cuprizone - 35 mus - 30 mus med moderat alvorlighetsgrad og 5 med mild alvorlighetsgrad (kontroller).
6. Hovedforsøk EAE - 35 mus - 24 mus med betydelig alvorlighetsgrad, 6 mus med moderat alvorlighetsgrad og 5 mus med mild alvorlighetsgrad.

Ved evt. senere forsøk kan følgende vurderes for å prøve å redusere belastningen:
- Kombinere EAE-score og vekttap med andre variabler slik som hastighet på vekttap siste par dager, og varighet på score 3.5, for eksempel.
- Før fremtidige forsøk utføre en pilot med titrering av pertussis-toxin, slik at EAE kan induseres, men slik at man kan identifisere dosen hvor musene utvikler lettere nevrologiske utfall som fremdeles gjør modellen valid vitenskapelig.

Det kan vurderes å overvåke musene tettere ved høy nevrologisk score, men det er usikkert om dette vil gjøre forsøket mindre belastende, siden de fleste musene bedrer seg raskt etter sykdomstoppen. Å avlive dem for tidlig vil kunne føre til at forsøket ikke blir valid.